三维细胞培养技术

自玻璃、塑料培养底物问世以来，科研人员开发了多种细胞、组织培养技术，部分技术经过改良被用于三维培养，但实际效果参差不齐。 最简单的是细胞沉淀团法：将分离得到的细胞置于试管底部，通过离心压实，再覆盖培养液[2]。该方法虽可以构建三维培养体系，但静态培养环境限制营养、氧气以及代谢废物的扩散，因此该技术并未得到广泛应用。

另一种简易方案：使用未做促贴壁处理的塑料培养瓶或培养皿培养贴壁依赖性细胞。细胞悬浮于培养基中，会随机聚集，形成体积大且形态不规则的细胞团。但大量细胞无法发生细胞间接触，进而发生凋亡死亡。此外，受静态培养体系扩散限制，大细胞团内部的细胞最终会因为营养、氧气供给不足发生坏死。

近年来，众多研究者采用三维水凝胶包埋细胞。细胞被包裹在凝胶基质内部，可自主排布，能够得到质量尚可的三维组织模型[3]。但该方法存在短板：静态培养条件限制物质传递，凝胶基质本身也会进一步阻碍扩散；同时该方案很难实现规模化放大。

还有悬滴培养法，原理和悬浮细胞聚团类似，区别在于细胞在微小液滴内聚集，能够得到形态更可控、均一的细胞球。但悬滴培养同样具备静态培养固有的扩散缺陷，并且换液操作繁琐，不适合长期培养。

SYNTHECON 旋转细胞培养系统（RCCS）

旋转细胞培养系统（RCCS）是一类生物反应器技术，其构建三维培养的机制与上述所有技术完全不同。该设备属于动态系统，将细胞置于低剪切应力、类微重力环境实现悬浮（详见下文 RCCS 工作原理），贴壁依赖型细胞可顺利聚集形成三维细胞球，同时实现营养、氧气的高效物质交换[4]。和搅拌瓶反应器不同，RCCS 悬浮细胞过程不会产生损伤细胞的机械作用力[5]，同时也可搭配多种支架材料使用。

RCCS 最初由美国国家航空航天局约翰逊航天中心研发，目的是模拟太空微重力环境。该设备基于回转器原理：通过单轴或双轴缓慢旋转，抵消重力的作用。NASA 研发的单轴设备称为旋转壁容器（RWV），RCCS 就是该设备的商业化产品。

“RCCS 是一套动态系统，可将细胞置于低剪切应力、类微重力的环境中实现悬浮。”

RCCS 工作原理

RCCS 为水平放置的圆柱腔体，腔体中心布置同轴供氧组件（图 1）。腔体内完全注满培养基；腔体旋转时，流体跟随腔壁运动，近乎整体刚体旋转。中心供氧组件固定不动，与外壁保持相同角速度，由此产生层流，剪切力维持在极低水平。

                           图 1：圆柱腔体水平旋转，营造类微重力环境（左）；安装在电机旋转底座上的 RCCS 腔体实物（右）。腔体与旋转底座整体放置于标准加湿 CO₂培养箱内工作。

细胞置于该环境中，受重力、离心力、科里奥利力三者共同作用，保持悬浮状态（图 2）。腔体旋转过程中，细胞或细胞团不断加速，直至达到沉降终末速度；此时重力被流体剪切力、离心力、科里奥利力抵消。沉降速度主要取决于细胞聚集体尺寸，根据斯托克斯方程，沉降速度随聚集体半径的平方增大而升高[4]。 因此，随着细胞团体积增大，沉降速度会变快，需要提高 RCCS 转速，维持细胞团悬浮，避免细胞团撞击腔壁造成损伤。

                     图 2：颗粒 P 在流体中旋转状态下的受力示意图。重力带来的沉降速度（Vs）可以分解为径向分量（Vsr）、切向分量（Vst）以及科里奥利力分量（Vct）；离心力产生向外的矢量。

腔体旋转时，细胞或细胞团加速直至沉降终末速度，重力被流体剪切力、离心力、科里奥利力平衡。沉降速度的决定性因素是细胞团大小，根据斯托克斯方程，沉降速度随半径平方增大而提升。因此细胞团增大后沉降变快，必须调高 RCCS 转速，保证细胞团悬浮，防止撞击器壁受损。

RCCS 与其他技术方案对比

凝胶包埋细胞

将神经干细胞包埋于三维胶原凝胶，放置于静态多孔板中培养，细胞可以分化形成神经元，并构建功能性突触。但经过一段时间后，静态体系氧气、营养扩散不足，细胞发生坏死。 将包埋后的细胞转移至 RCCS 动态培养体系（图 3），细胞不仅存活时间大幅延长（图 4），还能够构建结构复杂的类脑组织^[89]（图 5）。

                            图 3：从大鼠胚胎第 13 天的大脑皮层分离神经干 / 祖细胞，包埋于胶原，分别在静态多孔板与 RCCS 中培养。

                                                                                       图 4：静态培养条件下神经细胞前期增殖更快，但后期因营养氧气扩散受限大量死亡。RCCS 培养的神经细胞可以持续增殖，长时间维持细胞活性.

   图 5：大鼠发育中的大脑皮层 (a)：增殖的 Nestin+PCNA⁺神经祖细胞构成神经上皮层 (NE)；分化后的神经元、胶质细胞分布在皮层板 (CP) 区域。RCCS 胶原细胞构建体 (b)：I 层出现对应神经上皮层的 Nestin⁺、PCNA⁺细胞；II 层存在类似皮层板的 TuJ1⁺神经元细胞.

静态非贴壁培养板悬浮细胞

能够生成包含三胚层细胞的拟胚体，是胚胎干细胞的核心特征。早期制备拟胚体的方法，就是让细胞在非贴壁培养皿内自发聚集。但该方法可控性差，容易生成体积大、形态不规则的聚集体，静态扩散受限会造成聚集体中心坏死。 使用 RCCS 制备拟胚体，得到的细胞球体积更小、形态更均一，细胞存活率更高，分化效果也得到提升（图 6）。

                                                图 6：静态培养与 RCCS 培养得到的拟胚体对比

悬滴培养

悬滴培养依靠表面张力，将细胞悬浮在悬挂的液滴内。狭小液滴中的细胞发生聚集，形成三维细胞球。但作为静态培养技术，悬滴法同样存在物质扩散的局限。 一项胚胎干细胞向心肌细胞分化的对比研究表明：相较于悬滴培养，RCCS 培养的分化效率更高，心肌肌钙蛋白 T 表达水平更高（图 7）。

                                                                                      图 7：悬滴法与 RCCS 培养得到的胚胎干细胞球，置于分化培养基培养 5 天，开展心肌肌钙蛋白 T 免疫染色。

“对比悬滴培养，RCCS 可以实现更高的分化效率，目标基因表达水平更高。”

参考文献

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